ELISA法檢測細胞間黏附分子-1

細胞黏附分子（ICAM）是存在于細胞表面的一類具有復(fù)雜功能的糖蛋白，介導(dǎo)細胞之間的相互黏附，參與眾多的病理生理過程。目前，研究較多的黏附分子主要有免疫球蛋白超家族、整合素家族、選擇性家族、Cadherin家族等。細胞間黏附分子-1（ICAM-1）是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一員，由內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核細胞和上皮細胞表達，其配體是白細胞黏附分子CD18家族中的2個成員：即淋巴細胞功能相關(guān)抗原—1[lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-l（CDua／CDls）]和巨噬細胞抗原復(fù)合體-1[Mac-1（CD11a／CD18）]。正常肝組織中僅竇周細胞、門靜脈血管內(nèi)皮細胞有少量ICAM-1表達，肝細胞和膽管上皮細胞多為陰性。炎癥反應(yīng)過程中，ICAM-1是細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）接觸過程中起中心作用的一種細胞黏附分子，而炎癥細胞表面的LFA-1與靶細胞膜上的ICAM-1結(jié)合是*的過程。近年來，許多研究表明：ICAM-1與LFA-l介導(dǎo)的細胞間黏附，與肝細胞壞死的發(fā)生有十分密切的關(guān)系，而阻斷它們之間的相互作用或干擾它們的表達可能成為阻止肝細胞發(fā)生壞死的一種成功策略。由于ICAM-1與病毒性肝炎關(guān)系的研究是近年來肝病研究領(lǐng)域的新熱點，檢測方法和正常參考值的確立尚待完善。
[檢測方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。抗人slCAM-1單克隆抗體包被于微孔板上，加入標(biāo)本／標(biāo)準(zhǔn)品，使之與板上抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的單克隆抗體，未結(jié)合的部分被洗去，加入HRP的底物，若反應(yīng)孔中有slCAM-1，將出現(xiàn)顯色反應(yīng)，加終止液終止反應(yīng)。在450nm處測OD值，sI-CAM-1濃度與OD值之間成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中ICAM-l的濃度。
[試劑]
1．包被有抗人slCAM-1抗體的微孔板1塊
2．HRP結(jié)合的抗人slCAM-1單克隆抗體0．1ml／瓶
3．0．5ml 100ng／ml slCAM-1標(biāo)準(zhǔn)品2瓶
4．50ml濃縮洗滌液20X1瓶
5．5ml濃縮檢測緩沖液20Xl瓶
6。12ml樣品稀釋液1瓶
7．12ml TMB底物溶液1瓶
8．12ml終止液1瓶
9．封板膠紙2張
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測
[檢測步驟]
1.使用前先混勻所有試劑，應(yīng)注意避免起泡。
2．確定好空白、標(biāo)準(zhǔn)及待測所需孔數(shù)（每一份標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白及隨機選擇的對照應(yīng)測兩次）。
3．從已平衡至室溫的密封袋中取出所需的板條，洗板。
4．加樣，在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100u1樣品稀釋液，在待測孔中加入90u1樣品稀釋液。
5．每份標(biāo)本取10ul加入待測孔中，混勻。
6．在所有孔中加入50ul已稀釋的HRP結(jié)合物，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，置于100rpm搖床上室溫環(huán)境中（18～25℃）孵育1h，洗板。
7．在所有孔中加入100ul TMB底物稀釋液，包括空白孔。置于100rpm搖床上，避光室溫環(huán)境中（18～25℃）孵育約10min（視顯色深淺靈活掌握）。
8．加入終止液（100u1／孔）終止反應(yīng)，混勻后即刻測量OD450值。
注意：若孵育時未使用搖床則所獲OD值較低，但仍然有效。
[注意事項]
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30rain后方可使用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2．酶標(biāo)板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30～60s的洗滌浸泡時間。
3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。
4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應(yīng)注意安全。
5．每批樣本應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6．若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。
[臨床意義]
1．對TNF-β治療的乙型肝炎感染，slCAM是很好的診斷指標(biāo)。
2．眼葡萄膜炎、血管球性腎炎、HIV-1感染時，血漿slCAM-1升高。