1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈zui近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。

3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內。

4.  將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，這時為胰酶消化的zui適時機。若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細胞情況，可反復幾次，直至出現針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。

5. 吸取1ml細胞凍存液于培養(yǎng)瓶內，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞*脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。

6. 將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。

7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內3-4天，zui后存放于-196℃的液氮灌內長期保存。

   注此過程也可簡化因實際操作過程中經驗所得：步驟7結束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細胞株2-3月。